辣根過氧化物酶（HRP）是一種含亞鐵血紅素的蛋白質，廣泛分布于植物界，以在辣根中含量高而得名，分子質量約為40KDa。HRP作為酶標記抗體是通過共價鍵經適當的方法將酶聯接在抗體上，形成酶標抗體后再通過酶對底物的特異性催化作用，生成有色不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，利用肉眼、光學顯微鏡或電子顯微鏡可對結果進行觀察。

　　

　　HRP標記抗體用純化的待測物質抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入待測物質，再與HRP標記的待測物質抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成黃色。

　　

　　操作步驟：

　　

　　1.標準品的稀釋。

　　

　　2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

　　

　　3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

　　

　　4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

　　

　　5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

　　

　　6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

　　

　　7.溫育：操作同3。

　　

　　8.洗滌：操作同5。

　　

　　9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。

　　

　　10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

　　

　　11.測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

　　

　　注意事項：

　　

　　1.在具備高質量HRP的條件下，所要標記的抗體也要活性高，效價高（z低1∶16），純度高，親和力好，這是保證標記物效價高，免疫活性好的首要條件；

　　

　　2.所使用試劑的pH和濃度及用量必須嚴格掌握。所用試劑，新鮮配制。如在戊二醛標記法中所用戊二醛應為新鮮純品，因戊二醛儲存過久可形成縮和體（雜質），否則影響標記效果；

　　

　　3.室溫攪拌時須避光，室內溫度一般在25℃為宜。標記物每次透析前，需認真檢查防止漏液；

　　

　　4.濃的標記物相當穩(wěn)定，常加入30～40％甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀釋成1∶10，只能保存數周。已配制的使用液應在12小時內用完。切忌反復凍融。