辣根過(guò)氧化物酶（HRP）是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)，廣泛分布于植物界，以在辣根中含量高而得名，分子質(zhì)量約為40KDa。作為酶標(biāo)記抗體是通過(guò)共價(jià)鍵經(jīng)適當(dāng)?shù)姆椒▽⒚嘎?lián)接在抗體上，形成酶標(biāo)抗體后再通過(guò)酶對(duì)底物的特異性催化作用，生成有色不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，利用肉眼、光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡可對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察。

　　

　　HRP由無(wú)色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉結(jié)合而成，該酶的活性中心含鐵卟啉即輔基，在403nm波長(zhǎng)處呈現(xiàn)zui高吸收峰，酶蛋白部分吸收波長(zhǎng)為275nm，純度為二者的吸光度比值RZ，該酶與抗體標(biāo)記的方法有多種，根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)可分為戊二醛兩步法和過(guò)碘酸鈉法兩種方式標(biāo)記抗體。

　　

　　HRP抗體標(biāo)記的方法：

　　

　　一、戊二醛兩步標(biāo)記法

　　

　　戊二醛（GA）是常用的雙功能基團(tuán)交聯(lián)劑，它的兩個(gè)功能基可以與HRP和抗體上的氨基結(jié)合，形成HRP-GA-IgG結(jié)合物。在兩步法中先將酶與過(guò)量的GA反應(yīng)，形成二者的結(jié)合物，然后再將該結(jié)合物進(jìn)一步與抗體蛋白質(zhì)分子的氨基交聯(lián)，形成酶標(biāo)記抗體。

　　

　　二、簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉標(biāo)記法

　　

　　利用過(guò)碘酸鈉將HRP的糖基氧化成醛基，加入抗體IgG后該醛基與IgG氨基結(jié)合形成Schiff堿。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發(fā)生偶合，在用過(guò)碘酸鈉氧化前先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應(yīng)末了，用硼氫化鈉穩(wěn)定Schiff氏堿。此方法只適用于含糖量較高的酶。